Analyses XPS

Figure V.23: Spectres XPS du pic C1s après décomposition (à gauche) et Cu2p3/2 (à droite) d’une plaque d’or en présence de laccase A) Au1’ et B) Au2’

Des analyses XPS ont été réalisées sur les surfaces d’or fonctionnalisées et celles sur

940 938 936 934 932 930 928

20,0

928 930 932 934 936 938 940

19,2

171 l’immobilisation de l’enzyme à la surface des plaques et ce grâce à la présence du pic caractéristique de l’élément cuivre sur chacune des plaques.

Tableau V.7: Taux de couverture de la laccase des plaques d’or calculé à partir de l’activité enzymatique et des résultats XPS à partir du ratio ICu/IAu.

Au1’ Au2’

Taux de couverture à partir des résultats XPS Modèle A (hémispherique)

On a aussi comme pour les expériences réalisées à l’air déterminé le taux de recouvrement de la laccase à la surface des plaques d’or en utilisant les mêmes modèles mathématiques (Tableau V.7). D’après ce tableau, on obtient plus d’une monocouche de laccase à la surface des plaques. Par ailleurs on obtient les mêmes résultats que pour les expériences réalisées à l’air pour le même type de configuration. Ceci permet de montrer qu’on immobilise la même quantité de laccase en faisant circuler l’enzyme dans la cellule de PM-IRRAS pendant un temps beaucoup plus court que celui utilisé dans le protocole habituel. En effet l’immobilisation de la laccase a été effectuée durant 1h15-1h30 alors que dans le protocole d’immobilisation par trempage, ou dépôt d’une goutte de laccase sur une électrode de graphite la durée de mise en contact de la solution enzymatique avec la surface est de 2 heures.

V.3.

Conclusion

Dans la littérature ? peu d’études ont été réalisées afin de déterminer l’orientation de laccase à la surface d’un matériau en utilisant la technique de PM-IRRAS. Olejnik et al. [111]

ont immobilisé par adsorption la laccase Cerrena unicolor sur une surface d’or fonctionnalisée soit par de l’aminoethylphenyl chargé positivement (-C6H4(CH2)2NH3+) soit par de l’acide ethyl-benzoïque chargé négativement (-C6H4(CH2)2COO^-). Ils ont remarqué que dans le cas d’une fonctionnalisation de la surface d’or par des groupements chargés positivement, l’intensité des bandes amide I et II est significativement moins importante que pour une surface fonctionnalisée avec (-C6H4(CH2)2COO^-. Par ailleurs, ils ont constaté un shift vers des nombres

172 d’ondes plus importantS des bandes amide I et II qui pourrait être expliqué selon eux non pas par la dénaturation de la structure enzymatique (elle est toujours une activité catalytique après immobilisation) mais par un changement de l’état d’oxydation et une relaxation de la structure tertiaire.

Gutierrez-Sanchez et al. [112] ont immobilisé la bilirubine oxydase Myrothecium verrucaria sur une surface d’or fonctionnalisée par des SAMs chargés positivement (ATP) ou négativement (MHA). Ils ont aussi étudié l’orientation de cette enzyme par PM-IRRAS. Ils ont tout d’abord démontré en étudiant la structure cristallographique de la bilirubine oxydase que 34 % des liaisons amides sont localisés dans les feuillets , 19 % dans les hélices α et 23 % répartis de manière aléatoire. Les résultats de PM-IRRAS ont montré que les hélices α de la bilirubine sont disposées verticalement par rapport à la surface d’or (Figure V.24). Le ratio des bandes amides I et II est identique et ce quelle que soit la méthode de fonctionnalisation de la surface. Cela indique que l’orientation de la structure secondaire de l’enzyme est identique mais avec une rotation de 180° par rapport à la surface.

Figure V.24: Schéma de l’orientation de la bilirubine en fonction de son dipôle et de la charge de surface des SAMs A) MHA et B) ATP [112]

Ciaccafava et al. [113] ont immobilisé par adsorption une hydrogenase [NiFe] sur une surface d’or fonctionnalisée par des SAMs ayant un caractère hydrophile (S(CH2)nCOOH) ou hydrophobe (S(CH2)nCH3). Ils ont observé que l’immobilisation de la protéine sur la surface ne modifiait pas la structure secondaire de l’enzyme car la forme de la bande amide I reste

173 identique à celle mesurée par ATR-IR de l’enzyme déposée sur le cristal de Germanium du spectrophotomètre. Cependant l’orientation de l’enzyme est différente suivant le caractère hydrophile ou hydrophobe de la surface. Ils ont mesuré un ratio amide I/amide II de 6,5 et 4 pour une plaque d’or hydrophile et hydrophobe respectivement. En supposant que l’enzyme est uniquement composée d’hélices α (en réalité 40 % d’hélices α et 15 % de feuillets β) et que l’angle avec la surface est le même pour toutes les hélices, ils ont pu calculer un angle des hélices de 20° sur des surfaces hydrophobes et de 40° sur des surfaces hydrophiles.

En prenant en considération la littérature, et les résultats que nous avons obtenus, il est difficile, en se basant sur les feuillets β de la laccase, de déterminer une orientation particulière de l’enzyme. On peut simplement supposer la position des feuillets β sur le support. Néanmoins, on a pu mettre en évidence que l’orientation de la structure secondaire de l’enzyme est différentes pour les deux types de support (cystéamine ou acide thioglycolique). Sur une surface fonctionnalisée avec des groupements cystéamine, la contribution des vibrations des C=O est importante, on pourrait supposer que les feuillets  de l’enzyme sont orientés avec leur axe parallèle à la surface et leurs plans verticaux. Sur une surface fonctionnalisée avec de l’acide thioglycolique, on aurait d’un pivotement de 90° de l’enzyme. L’axe des feuillets  serait perpendiculaire. L’étude in situ par PM-IRRAS nous a permis d’évaluer le temps d’activation des groupements carboxyliques et de mettre en évidence la présence de groupements non activés sur une plaque d’or fonctionnalisée par un SAM d’acide thioglycolique. Elle nous a aussi permis de voir que l’immobilisation sous cloche ou en flux continu de la laccase conduit à la même orientation des feuillets β. Il s’agit ici de la première étude sur le suivi de l’immobilisation de la laccase in situ réalisée par PM-IRRAS. L’étude XPS quant à elle a montré que la laccase forme une monocouche à la surface des plaques d’or quel que soit le type de fonction (amine ou carboxylique).

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