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B- Méthodes

3- Amplification et séquençage des régions génomiques NS3, NS5B et

Figure 40: Représentation schématique des bandes du test de génotypage (LIPA) VERSANT HCV version 2.0 (bande 1 : génotype 4 ; bandes 2 et 3 : génotype 3a ; bande 4 : contrôle négatif ; bande 5 : génotype 2b ; bande 6 : génotype 1a). CONJ CTRL : contrôle du conjugué ; AMPL CTRL : contrôle d’amplification.

3- Amplification et séquençage des régions génomiques NS3, NS5B et NS5A

La technique d’extraction utilisée a été décrite plus haut (paragraphe 2-1)

3-1- Amplification de la protéase NS3 3-1-1-Transcription inverse et PCR externe

Il s’agit d’une transcription inverse suivie directement d’une PCR en une seule étape (one-step PCR), réalisée avec le kit SuperScriptTM III : « One-Step RT-PCR system with Platinum®Taq High Fidelity DNA Polymerase » (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). 10µl d’ARN extrait sont ajoutés à 15µl du mix RT-PCR composé pour chaque échantillon de 12,5µL de tampon 2X, 0,5µl de l’amorce sens Mars F3 à 10µM, 0,5µl de l’amorce antisens Mars R2 à 10µM (Tableau 3), 0,5µl de l’enzyme SuperScriptIII/Platinum et 1µl d’eau stérile.

Les tubes sont mis dans un Primus HT thermocycleur (MWG Biotech AG, Germany) pour réaliser la RT pendant 30 min à 55°C suivie de l’amplification génomique avec une dénaturation à 94°C pendant 2 min suivie de 35 cycles d’amplification comportant chacun une dénaturation à 94°C pendant 30 sec, une hybridation à 59°C pendant 1 min et une élongation à 68°C pendant 1 min, puis une élongation supplémentaire à 68°C pendant 5 min pour le dernier cycle. Cette PCR permet l’amplification d’un fragment de 745 pb (Figure 41).

3-1-2- PCR interne

La PCR interne a été réalisée avec le kit AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France). Elle a été conduite dans un volume réactionnel total de 100µl contenant 2µl de produit de la RT-PCR et 98µl de mix PCR. Le mix est constitué de 10µl de tampon 10X, 10µl de MgCl2 25mM, 2µl de dNTP 10Mm, 1µl de l’amorce sens NS3G1F-Mu à 20µM, 1µl de l’amorce anti sens Mars R2 à 20µM (Tableau 3) (amorce déjà utilisée pour la RT), 0,4µl de l’enzyme AmpliTaq Gold et 73,6 µl d’eau stérile. Les tubes sont ensuite mis dans un Primus HT thermocycleur (MWG Biotech AG, Germany) pour subir 30 cycles d’amplification, précédés par une étape de dénaturation de 12 min à 94°C. Chaque cycle comporte une dénaturation à 94°C pendant 30 sec, une hybridation des amorces à 53°C pendant 1 min et une élongation à 72°C pendant 1 min. Le dernier cycle comporte une étape d’élongation supplémentaire à 72°C pendant 7 min. Cette PCR permet l’amplification d’un fragment de 712 pb (Figure 41).

Noms Sequences 5’-3’ Position (nt) TH°C

Mars F3 ACSGCRGCRTGYGGGGACAT 3309-3328 75,6

Mars R2 GTGCTCTTRCCGCTRCCTCT 4035-4054 65,8

NS3G1F-MU CCYCTCTCYGCYCGWAGGGG 3342-3361 70,6

Demi R2 TCRACRTTRGTRTACATYTG 3636-3655 53,3

Demi F3 CARATGTAYACYAAYGTRGA 3636-3655 54,7

Figure 41: Position des amorces utilisées pour l’amplification de la protéase NS3 du VHC de génotype 1

3-2- Amplification de la polymérase NS5B 3-2-1- Transcription inverse et PCR externe

La stratégie d’amplification est la même que celle décrite pour NS3. 10µl d’extrait d’ARN sont ajoutés à 40µl du mix RT-PCR composé pour chaque échantillon de 25µL de tampon 2X, 1µl de l’amorce sens MD7580G1-S à 10µM, 1µl de l’amorce antisens LP11ab-AS à 10µM (Tableau 4), 1µl de l’enzyme SuperScriptIII/Platinum et 12µl d’eau stérile. Les tubes sont placés dans un Primus HT thermocycleur (MWG Biotech AG, Germany) pour réaliser la RT pendant 30 min à 50°C suivie de l’amplification génomique comportant une dénaturation à 94°C pendant 2 min suivie de 50 cycles d’amplification comportant chacun une dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une hybridation à 58°C pendant 30 sec et une élongation à 68°C pendant 2 min, puis une élongation supplémentaire à 68°C pendant 5 min pour le dernier cycle. Cette PCR permet l’amplification d’un fragment de 1792 pb (Figure

42).

3-2-2- PCR interne

L’amplification de la polymérase NS5B a été réalisée en effectuant quatre PCR internes. Elle est réalisée dans un volume réactionnel de 50µl contenant 2µl de produit de la RT-PCR et 48µl de mix PCR. Le mix PCR est identique pour les quatre PCR internes, il est constitué de 5µl de tampon 10X, 1µl de dNTP à 10 mM, 1,5µl de MgCl2, 1µl de l’amorce sens à 10µM, 1µl de l’amorce antisens à 10µM, 0,5µl de l’enzyme AmpliTaq Gold et 38 µl d’eau stérile. Quatre fragments de la polymérase NS5B de taille 309 pb, 742 pb, 427 pb

et 399 pb ont été amplifiés. Le premier fragment a été amplifié avec l’amorce sens MD7918 et l’amorce antisens MD7930G1-AS, le deuxième avec l’amorce sens MD7930G1-S et l’amorce antisens ENO2GI-AS, le troisième avec l’amorce sens NS5B3-S et l’amorce

antisens NS5B-2AS et le dernier avec l’amorce sens NS5B1-S et MD9323 (Tableau 4) (Figure 42). Les tubes sont ensuite placés dans un Primus HT thermocycleur (MWG Biotech AG, Germany) pour 40 cycles d’amplification, précédés par une étape de dénaturation de 2 min à 94°C. Chaque cycle comporte une dénaturation à 94°C pendant 30 sec, une hybridation des amorces à 55°C pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 1 min 15 sec. Le dernier cycle comporte une étape d’élongation supplémentaire à 72°C pendant 7 min.

Noms Sequences 5’-3’ Position (nt) TH°C

MD7980G1-S ACGGARGAYGTCGTSTGCTGCTC 7581-7603 66 Lp11ab-AS CGGTTGGGGAGSAGGTARATGCCTACCCCTRC 9342-9373 74,6 MD7918 GGACAGGCGCCCTGATCACRCCATGCGC 7618-7645 74,6 MD7930G1-AS CGGACGTCYTTTGCCCCATAGCCAAA 7902-7927 67,2 MD7930G1-S TTTGGCTATGGGGCAAARGACGTCCG 7902-7927 67,2 ENO2G1-AS GCDGAGTACCTRGTCATAGCCTCCGTGAA 8616-8644 69,3 NS5B3-S GYCTTCACGGAGGCTATGACYAGG 8613-8636 66,1 NS5B2-AS CCTGGAGAGTAACTRTGGAGTGAAAATGC 9012-9040 66 NS5B1-S GCCTGYTACTCCATWGARCCACTKG 8949-8973 65,4 MD9323 CCCCTACAGAAAGTAGGAGTAGGCAC 9323-9348 66,4

Tableau 4: Amorces utilisées pour l’amplification et le séquençage de la polymérase NS5B

Figure 42: Position des amorces utilisées pour l’amplification de la polymérase NS5B du VHC de génotype 1

3-3 Amplification de la région NS5A

3-3-1- Transcription inverse et PCR externe

Comme précédemment l’amplification a été réalisée en une étape. 5µl d’extrait d’ARN sont ajoutés à 20µl du mix RT-PCR composé pour chaque échantillon de 25µl de tampon 2X, 1µl de l’amorce sens à 10µM, 1µl de l’amorce antisens à 10µM, 1µl de l’enzyme SuperScriptIII/Platinum et 6µl d’eau stérile. Deux couples d’amorces différents ont été utilisés pour chaque sous-type viral (Tableau 5). Pour le sous-type 1a, l’ARN du VHC a été amplifié avec l’amorce sens 1a-NS5A-F0 et l’amorce antisens 1a-NS5A-R0. Pour le sous-type 1b, l’ARN du VHC a été amplifié avec l’amorce sens 1b-NS5A-F0 et l’amorce antisens 1b-NS5A-R0. Les tubes sont placés dans un Primus HT thermocycleur (MWG Biotech AG, Germany) pour une RT pendant 30 min à 50°C suivie de l’amplification génomique comportant une dénaturation à 94°C pendant 10 min. suivie de 40 cycles d’amplification comportant chacun une dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une hybridation à 60°C pendant 30 sec et une élongation à 68°C pendant 2 min, avec une élongation supplémentaire à 68°C pendant 10 min pour le dernier cycle. Cette PCR permet l’amplification d’un fragment de 1345 pb (Figure 43).

3-3-2- PCR interne

L’amplification de la région NS5A du VHC a été réalisée en effectuant deux PCR internes dans un volume réactionnel de 50µl contenant 2µl de produit de la RT-PCR et 48µl de mix PCR. Le mix PCR est identique pour les deux PCR internes, il est constitué de 5µl de tampon 10X, 1µl de dNTP à 10 mM, 1,5µl de MgCl2, 1µl de l’amorce sens à 10µM, 1µl de l’amorce antisens à 10µM, 0,5µl de l’enzyme AmpliTaq Gold et 38µl d’eau stérile. Deux fragments de la région NS5A de taille 818 pb et 648 pb ont été amplifiés. Pour le sous-type 1a, le premier fragment a été amplifié avec l’amorce sens 1a-NS5A-F1 et l’amorce antisens NS5A-SeqR, le deuxième avec l’amorce sens NS5A-SeqF et l’amorce antisens 1a-NS5A-R0, la même amorce que celle utilisée au niveau de la RT-PCR (Figure 43). Pour le sous-type 1b, le premier fragment a été amplifié avec l’amorce sens 1b-NS5A-F1 et l’amorce antisens 1b-NS5A-SeqR et le deuxième avec l’amorce sens 1b-NS5A-SeqF et l’amorce antisens 1b-NS5A-R0, la même amorce que celle utilisée au niveau de la RT-PCR (Tableau

5) (Figure 44). Les tubes sont ensuite placés dans un Primus HT thermocycleur (MWG

Biotech AG, Germany) pour 40 cycles d’amplification, précédés par une étape de dénaturation de 10 min à 95°C. Chaque cycle comporte une dénaturation à 95°C pendant 30 sec, une hybridation des amorces à 56°C pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 2 min, le dernier cycle comportant une étape d’élongation supplémentaire à 72°C pendant 10 min.

Noms Sequences 5’-3’ Position (nt) TH°C

1a-NS5A-F0 GACATCTGGGACTGGATATGYGA 6276-6298 61,5 1a-NS5A-R0 GTCCAGGWRTARGACATYGAGCA 7599-7621 61,5 1a-NS5A-F1 GATATGYGAGGTGYTGAGCGA 6290-6310 59,8 1a-NS5A-SeqR AAGGAGTCCARRATCACCAC 7089-7108 57,3 1a-NS5A-SeqF ARCTGTCYGCWCCATCTCTCAAGG 6955-6978 64,4 1b-NS5A-F0 GAYGTTTGGGAYTGGATATGCAC 6276-6298 60,6 1b-NS5A-R0 GTCCAYGWRTARGACATYGAGCA 7599-7621 60.6 1b-NS5A-F1 GATATGYACGGTGYTGAYTGA 6290-6310 56,9 1b-NS5A-SeqR AARGAGTCCARRATYACYAC 7089-7108 54,2 1b-NS5A-SeqF ARCTGTCYGCWCCATCTCTCAAGG 6955-6978 63,3

Figure 43: Position des amorces utilisées pour l’amplification de la région NS5A du VHC de génotype 1a

Figure 44: Position des amorces utilisées pour l’amplification de la région NS5A du VHC de génotype 1b

3-4- Séquençage des produits amplifiés

Au niveau de la protéase NS3, quatre amorces ont été utilisées pour le séquençage bidirectionnel : NS3G1F-Mu/demi F3 pour le premier fragment et demi R2/Mars R2 pour le deuxième (Tableau 3).

Les mêmes amorces utilisées au niveau de la PCR interne pour l’amplification de la polymérase NS5B ont été utilisées pour le séquençage de cette région (Tableau 4).

Concernant la région NS5A, le séquençage a été effectué avec les mêmes amorces que celles utilisées lors de la PCR interne pour l’amplification des deux sous-types viraux 1a et 1b (Tableau 5).

La technique de séquençage utilisée est la même que celle décrite dans le chapitre 2-2 « Séquençage partiel de la région NS5B », pages 76-77.

3-5- Analyses phylogénétiques et vérification moléculaire du génotype

Des analyses phylogénétiques ont été conduites sur les séquences NS3 et les séquences de 1792 nucléotides en NS5B afin de déterminer le génotype de nos souches et de comparer les résultats avec le génotypage préalablement déterminé par le test d’hybridation de sonde INNOLiPA ou par séquençag d’un fragment plus petit en NS5B.Les séquences obtenues dans les deux régions NS3 et NS5B ont été alignées et comparées avec des séquences de référence appartenant aux différents génotypes et sous-types du VHC publiées dans GenBank (Tableau

6). Ces analyses phylogénétiques ont été réalisées sur un fragment de 722 pb pour la région

NS3 et un fragment de 1730 pb pour la région NS5B.

L’alignement des séquences et la réalisation des arbres phylogénétiques sont basés sur le même principe que celui utilisé pour le génotypage des souches VHC en Tunisie. Ces techniques ont été décrites plus haut (Paragraphe « Analyse phylogénétique et caractérisation moléculaire).

3-6- Alignement des séquences et analyse des sites associés à des mutations de résistance

Quatre séquences ont été obtenues pour les régions NS3 et NS5A, huit pour la région NS5B. Les fichiers ab1 fournis directement par le séquenceur, correspondant aux séquences sens et antisens, ont été traités avec le logiciel SeqScape v 2.7 (Applied Biosystem, Courtaboeuf, France). L’analyse des séquences obtenues comporte deux étapes :

 Une correction des séquences exportées, si nécessaire, et déduction de la séquence finale appelée « séquence consensus » pour chaque échantillon.

 Alignement des séquences consensus des différents échantillons avec la séquence de référence et identification des mutations de résistance sur les séquences nucléotidiques et sur les séquences traduites en AA.

L’alignement des séquences de la région NS3 a été effectué avec la séquence de référence AJ238799 de génotype 1b isolé en Allemagne en 2005. Les séquences NS5B ont été alignées avec la séquence de référence AF207764 de génotype 1b isolé au Japon en 2007. Concernant les séquences NS5A l’alignement a été effectué avec la séquence de référence AF009606 pour le sous-type 1a isolé en Amérique en 1997 et la séquence de référence AY045702 pour le sous-type 1b isolé au Japon en 2007.

Génotype Sous-types Numéro d’accession Origine Année d’isolement 1 1a EF407419 Amérique 2008 1 1a M62321 Amérique 2007 1 1a AF511950 Amérique 2002 1 1a M67463 Amérique 2007 1 1b AY587016 Chine 2004 1 1b D11355 Japon 2007 1 1b AY003965 Angleterre 2001 1 1b AJ291273 France 2005 1 1b AY003957 Angleterre 2001 1 1c D14853 Indonésie 2005 1 1c AY051292 Inde 2005

1 1d AF037233 Burkina Faso 2001

1 1d L38377 - 1995 1 1e L38361 Cameroun 1995 1 1f L38371 France 1995 1 - AJ291257 France 2005 1 1g AM910652 Espagne 2008 2 2a AY746460 Japon 2007 2 2a AB047639 Japon 2005 3 3a AJ291256 France 2001 3 3a X76981 Allemagne 2005 4 4a Y11604 Egypte 2005 4 4a AF271812 Egypte 2000 5 5a D50467 Japon 1999

6 6a AY859526 Hong Kong 2005

6 6a D87356 Vietnam 1999

Tableau 6: Séquences de référence de GenBank utilisées pour la construction des arbres phylogénétiques