Accord du comité d’éthique local

Tous les protocoles impliquant des animaux ont été visés par le Comité Rennais d’Éthique en matière d’Expérimentation Animale et approuvés sous les numéros R-2012-CCh-01 et R-2012-ClCh-01.

II. Les méthodes

1. PLAN EXPÉRIMENTAL

Le choix de la période de traitement (entre 0 et 3 jpn) a été dicté par la physiologie du développement ovarien. En effet, cette période est riche en modifications conditionnant la vie reproductive entière de l’animal. Le plan expérimental (présenté en figure 38) est articulé en trois parties utilisant des protocoles distincts.

La première partie a trait aux effets immédiats d’un traitement à l’œstradiol sur le métabolisme de cette hormone, l’évolution à court terme du stock ovocytaire et la caractérisation de l’apoptose. Il s’agit également de comparer les effets de 4 doses différentes.

La deuxième partie s’intéresse aux conséquences à moyen et long termes du traitement à 2 doses d’œstradiol (une dose dite « forte » et une dose dite « faible ») sur la première vague de croissance folliculaire, la survenue de la puberté et les capacités reproductives des animaux traités ainsi que leurs profils hormonaux.

La troisième partie évalue l’impact immédiat du traitement (à 2 ou 3 doses) sur le transcriptome ovarien et les dommages infligés à l’ADN, deux types d’atteintes potentiellement à l’origine des modifications des phénomènes observés de façon précoce dans l’organe mais aussi des troubles constatés chez l’animal adulte.

2. SUIVI PHYSIOLOGIQUE

À 28 jours commence la surveillance quotidienne des signes d’ouverture vaginale indiquant la puberté. Lorsque l’ouverture vaginale est constatée, les rattes sont pesées et soumises à un frottis journalier afin de détecter le premier œstrus et établir la durée de leurs cycles. Les frottis sont réalisés chaque matin à heure fixe pendant trois semaines à l’aide d’une anse bactériologique en plastique, déposés dans une goutte de sérum physiologique (NaCl 9‰) sur des lames de verre, séchés à l’air libre et colorés (5 min hématoxyline, rinçage à l’eau, 5 min éosine, rinçage à l’eau, 5 min alcool 96%).

Estomac Foie

Rein

Corne utérine gauche Ovaire + oviducte

Ovaire

Ovaire débarrassé de la capsule échelle : un carré = 1mm² Oviducte

Pour évaluer les capacités de reproduction des femelles, elles sont mises en contact avec un mâle (non traité, issu de l’élevage du laboratoire) durant 5 jours et 5 nuits consécutifs afin de couvrir un cycle estrien complet, et ce à l’âge de 2, 3 et 4 mois. Les éventuelles gestantes sont isolées en cage individuelle en attendant la mise-bas. Le déroulement de celle-ci est surveillé, afin de s’assurer qu’elle se déroule bien. Dans le cas contraire, il existe un risque de rejet des petits de la part de la mère. Les soins apportés aux nouveau-nés sont également surveillés (la mère élimine les placentas, lave ses petits, les regroupe pour les maintenir au chaud et les allaite). Si une mère ne prodigue pas de soins à ses petits, il est possible de les faire adopter quelques heures après la naissance par une autre mère ayant des petits du même âge. Ceci permet en outre d’équilibrer le nombre de femelles par portée.

3. EUTHANASIE

Bien que figurant parmi la liste des méthodes d’euthanasie recommandées par les comités d’éthique en expérimentation animale, la méthode utilisée au cours de cette étude a été imposée par les besoins expérimentaux. Il fallait en effet une méthode extrêmement rapide pour bénéficier des derniers battements cardiaques post-mortem afin de récupérer le sang des animaux. Ceci

excluait l’endormissement au CO2, très long et de toute façon inadapté aux animaux en dessous de

10 jours, extrêmement résistants à l’hypoxie. Il fallait également une méthode n’entrainant pas de modifications des paramètres sanguins pouvant interférer dans les dosages hormonaux envisagés. Ceci excluait donc aussi l’euthanasie par injection d’une dose létale d’anesthésique. Les petits animaux (jusqu’à 6 jours) sont donc décapités à l’aide d’une paire de ciseaux. Les adultes sont également décapités, pour les mêmes raisons, à l’aide d’une guillotine.

4. DISSECTION

Après décapitation, le sang est récupéré soit via une pipette munie d’un cône à filtre hépariné (cas des animaux de moins de 6 jours) soit via un entonnoir (cas des pré-pubères et des adultes). Ce sang est centrifugé une heure à 3000 rpm (centrifugation douce, centrifugeuse Eppendorf 5417R). La phase supérieure, le plasma, est ensuite récupérée puis conservée à -20°C en vue des dosages hormonaux.

L’animal décapité est ensuite étendu sur le dos pour le prélèvement de ses organes (figure 39) :

- Chez la femelle de moins de 6 jours : ovaires, oviductes, foie, cerveau

- Chez la femelle de 21 jours et plus : ovaires, oviductes, utérus, reins, hypophyse

A. Animal de moins de 6 jours

La cavité abdominale est ouverte à l’aide de ciseaux fins en réalisant une boutonnière entre le nombril et la papille urinaire. La boutonnière est d’abord élargie latéralement et l’incision se poursuit le long des flancs de l’animal en remontant en direction de la cage thoracique. À cet âge, l’ovaire est lisse et en forme de haricot. Il est situé au bout des cornes utérines à proximité des reins dans une capsule en partie constituée par l’oviducte. Son prélèvement requiert des instruments adaptés à sa petite taille, on utilise donc des outils de microchirurgie optique. L’ovaire, encore

Ovaire gauche Oviducte gauche Corne utérine gauche

Vagin

entouré de sa capsule, est déposé dans une boite de Pétri contenant du PBS 1X pour être post-disséqué sous loupe binoculaire et débarrassé de sa capsule. Il est ensuite fixé (soit au

paraformaldéhyde 4% en vue d’une inclusion en tissu teck pour hybridation in situ, soit dans du

liquide de Bouin pour être ensuite inclus en paraffine pour étude histologique) soit congelé à sec et conservé à -80°C pour en extraire les ARN.

Un morceau de foie est prélevé sur le lobe principal puis congelé à sec et conservé à -80°C en vue de l’extraction des ARN.

Le cerveau est récupéré en ouvrant la boite crânienne (encore fragile) latéralement à droite et à gauche puis sur la partie antérieure vers le museau. Elle peut alors être retirée pour découvrir le cerveau. Celui-ci est ensuite immergé dans du paraformaldéhyde 4 %.