Études in vivo

3.1 Animaux

Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant des souris C57Bl/6j mâles, âgées d’environ 12 semaines et d’un poids moyen de 24-29 g. Les souris ont été hébergées en cages collectives (5 par cage) sous conditions contrôlées de température de 22 ± 2°C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h, avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d'éthique régional de Normandie (Autorisation

Culture de cellules

Lavage des cellules par le tampon

Marque des cellules avec le DCFDA pendant 30 - 45 min à 37 ºC

Lavage des cellules par le tampon

Traitement des cellules avec le MPP+ et le PSELT

Mesure de la fluorescence (Ex / Em = 485/535 nm) dans un lecteur de microplaque

du 24 novembre 1986 (86/609/CEE). 3.2. Administration du PSELT

Nous avons dans un premier temps étudié la capacité du peptide PSELT à atteindre le système nigro-strié après administration par voie intranasale. Pour ce faire, nous avons utilisé un peptide PSELT couplé à un peptide TAT afin de localiser le PSELT dans le cerveau grâce à un anticorps dirigé contre le peptide TAT (Figure 32).

Figure 32. Schéma expérimental montrant le protocole expérimental d’administration du peptide PSELT lié au TAT chez la souris C57Bl/6j par voie intranasale.

3.3 Traitements par le MPTP

Le MPTP dont la formule chimique est montrée dans la figure 33 a été utilisé pour mimer le parkinsonisme chez la souris.

MPTP: C12H15N

Figure 33. Structure et formule chimique du MPTP.

Dans ce travail de thèse, plusieurs protocoles d’administration du MPTP et d’analyse du comportement ont été utilisés:

PSELT/TAT

2 h après

sacrifice des souris

4 h après

sacrifice des souris PSELT/TAT

3.3.1. Protocole expérimental n° = 1

Dans ce protocole, nous avons choisi la procédure utilisée par Ciesielska et ses collaborateurs avec une dose administrée de MPTP de 60 mg/kg en 4 injections de 15 mg/kg en intrapéritonéale (i.p.) toutes les 2 h. Ce protocole d’administration induit une dégénérescence des neurones dopaminergiques qui se rapproche du stade précoce de la MP (Ciesielska et al., 2009).

Typiquement, les animaux ont été divisés en 4 groupes de 5 à 10 animaux : - Groupe 1 (G1) : animaux contrôles traités uniquement par du NaCl 0.9% .

- Groupe 2 (G2) : animaux traités uniquement par le PSELT 30µg/10µl de tampon. - Groupe 3 (G3) : animaux traités uniquement par du MPTP.

- Groupe 4 (G4) : animaux traités par du MPTP et du PSELT.

Au début de l’expérience, les souris reçoivent par voie intrapéritonéale4 doses de MPTP-HCl (Sigma-Aldrich) à 15 mg/kg ou du tampon à 2 h d’intervalle. Ensuite, les animaux reçoivent 1 injection intranasale (i.n.) de 30 µg/10 µl de PSELT (5 µl/narine) ou du tampon quotidiennement pendant 5 j. Des tests de comportement accompagnant les traitements ont été réalisés comme expliqué dans le schéma suivant (Figure 34).

Figure 34. Schéma du protocole expérimental n° = 1 utilisé pour l'administrateur de MPTP et de PSELT ou du tampon chez les animaux traités ou contrôle.

Jour 0 Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4 Jour 5 Jour 8

4 injections i.p MPTP 15 mg/Kg à 2h intervalle

pour G3 & G4

4 injections i.p. NaCl 0.9% pour G1 & G2

Tests comportementActimètrie & Locotronic Prélèvement

Jour 9

1 injection i.n. PSELT 30 µg/10 µl (G2 & G4) 1 injection i.n. NaCl 0.9% (10 µl) (G1 & G3)

MPTP+PSELT (G4) n = 5 MPTP (G3) n = 5 PSELT (G2) n = 5 Contrôle (G1) n = 5

3.3.2 Protocole expérimental n° = 2

Les animaux ont été divisés en 4 groupes expérimentaux: contrôle ayant reçu uniquement du NaCl 0.9% (G1), un groupe traité par le PSELT (G2), un groupe traité par le MPTP (G3) et un groupe traité par le MPTP et le PSELT (G4). Les souris des groupes 3 et 4 ont reçu des injections par voie i.p.de 30 mg/kg de MPTP du jour 0 jusqu’au jour 4. Les souris des groupes 2 et 4 ont reçu 1 injection par voie i.n. de 30 µg/10 µl de PSELT (5 µl/narine) quotidiennement pendant 5 j. Les animaux témoins ont été traités uniquement avec du NaCl par voie i.p. et par voie i.n.. Des tests de comportement accompagnant les traitements ont été réalisés suivant le schéma ci-dessous (Figure 35).

Figure 35. Schéma du protocole expérimental n° = 2montrantles temps utilisés pour l’administration du MPTP et du PSELT ou du tampon salin.

3.3 Tests de comportement

L'objectif des analyses comportementales est d'évaluer la capacité du peptide PSELT à inhiber les troubles moteurs dans les modèles de la MP chez la souris. Plusieurs tests de comportement ont été utilisés au cours de cette étude. Ces tests ont permis d'évaluer:

1- L’activité motrice globale à l’aide d’un actimètre « Open field », 2- La coordination motrice des animaux à l’aide du test du rotarod.

3.3.1 Évaluation de l’activité motrice globale : Actimètrie «Open field»

L’actimètre «Open field» permet d'évaluer le retard moteur, la réponse à la nouveauté, le mécanisme d’habituation, l’exploration, les réponses au stress, l’anxiété, les effets sédatifs, les rythmes circadiens, etc (Ghoshet al., 2012). L’actimètre utilisé mesure L= 20cm, I= 20cm et

1 injection i.n. PSELT 30 µg/10 µl (G2 & G4) 1 injection i.n. NaCl (10µl) (G1 & G3)

Jour 0 Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4 Jour 5 Jour 7

Prélèvement

1 injection i.p. MPTP 30 mg/Kg (G3 & G4) 1 injection i.p. NaCl 100 µl (G1 & G2)

Test ComportementActimètrie & Rota-rod

Jour 8 MPTP+PSELT (G4) n= 12 MPTP (G3) n= 12 PSELT (G2) n= 12 Contrôle (G1) n = 12

hauteurs différentes. Il permet de quantifier 3 types de mouvements: horizontaux, stéréotypés et les redressements (Belujon et al., 2007). Les tests sont réalisés dans des pièces calmes et les souris sont placées dans la salle d’expérimentation 30 min avant le test, permettant ainsi aux animaux de s’acclimater à ce nouvel environnement et d’éviter les réponses de type néo-phobiques. Chaque souris a été placée dans l’actimètre pendant 30 min et son activité a été enregistrée automatiquement comme montré dans les images suivantes (Figure 36).

Figure 36. Photographie de l’équipement utilisé et d’une souris placée dans l’actimètre au cours du test.

3.3.2. Évaluation de la coordination motrice par le rotarod

Le rotarod est un test standard pour l’évaluation de la coordination motrice, l'équilibre et la fatigue des rongeurs. Il constitue une solution idéale pour étudier les dommages du système nerveux central et les effets de différentes pathologies sur la coordination motrice. Le rotarod

RotamexTM rotarod (Columbus Instruments, Columbus, OH) utilisé est constitué de cylindres

en plastique de 3 cm de diamètre qui forment quatre compartiments identiques. Les animaux ont été placés pendant 4 min (240 sec) sur le tambour face au mur de telle sorte que le cylindre ait un sens de rotation opposé à la direction de l’animal comme montré dans la photographie ci-dessous (Figure 37).

Figure 37. Photographie du rotarodutilisé et des souris placées sur le tambour à voies multiples: L'animal est placé sur le tambour à voies multiples du rotarod et le temporisateur est démarré. Lorsque l'animal tombe, en toute sécurité dans son propre couloir, le temps de chute (en minutes et secondes) et la vitesse de rotation sont automatiquement enregistrés.