Établissement de lignées transgéniques rapportrices de l’expression d’Hes4

Dans le document Rôle des répresseurs transcriptionnels Hes1/4 dans la maintenance des cellules souches rétiniennes chez Xenopus laevis (Page 153-157)

III. Résultats

3. Établissement de lignées transgéniques rapportrices de l’expression d’Hes4

l’expression d’Hes4

Nos résultats sur le profil d’expression de Hes1/4 au cours de la rétinogenèse embryonnaire suggèrent fortement que les cellules situées à la frontière EPR/rétine neurale au stade vésicule optique préfigurent les futures cellules souches adultes. Cependant, cette hypothèse nécessite des études de lignage pour être formellement démontrée.

Nous avons donc décidé de générer des animaux transgéniques rapporteurs de l’activité du promoteur Hes4. Une séquence d’environ 500pb du promoteur Hes4a a précédemment été publiée et s’est démontrée capable de reproduire le profil d’expression du gène dans les somites (Davis et al., 2001). Afin de vérifier que cette séquence était également suffisante pour reproduire le profil d’Hes4 pendant la rétinogenèse embryonnaire, nous l’avons clonée en aval de l’eGFP (codant une protéine GFP stable) et de la Turbo-GFP (codant une GFP déstabilisée) et nous avons généré des animaux transgéniques par la technique REMI (Figure 30A). Le taux d’embryons F0 transgéniques pour la construction promHes4a-eGFP, sélectionnés grâce à la fluorescence de l’eGFP, s’est avéré assez faible (environ 3% de transgéniques). Ce taux n’a pas été évalué chez les embryons transgéniques

promHes4a-TurboGFP car nous n’avons pas pu visualiser la fluorescence de cette GFP. Pour tester si le

promoteur Hes4a est capable de reproduire le profil d’expression d’Hes4 dans la ZMC post-embryonnaire, nous avons réalisé des hybridations in situ avec les sondes eGFP et TurboGFP sur une dizaine de têtards transgéniques de la génération F0 (Figure 30B). Certains embryons présentent des patrons d’expression différents de celui attendu, y compris dans la rétine,

Phases du cycle cellulaire (h)!

Growth fraction " (%±s.e.m)! Tc-Ts! TS! TC! TG2! TM! TG1! Ctrl! 3,62! 7,00! 10,62! 1,20! 0,43! 1,99! 84,48%! Hes1-GR! 6,90! 6,56! 13,46! 1,90! 0,25! 4,75! 95,01%!

probablement en raison d’ « effets de position » du transgène. Néanmoins, quelques embryons montrent un marquage restreint à la ZMC, bien que plus étendu que celui de Hes4a endogène. Ces résultats sont encourageants mais nécessitent d’être vérifiés et complétés par une analyse sur des individus F1 (les transgènes sont souvent dérégulés en F0). Pour ce faire, nous avons élevé des animaux transgéniques F0 jusqu’à l’âge adulte et les avons croisés avec des animaux sauvages pour produire la génération F1. L’analyse du patron d’expression du transgène au cours de la rétinogenèse a pu être réalisée sur les descendances de deux animaux transgéniques promHes4a-eGFP. Chez la première descendance, l’expression du transgène s’est avérée totalement différente de celle de Hes4 (marquage ubiquitaire dans la rétine aux stades précoces et expression limitée à l’EPR et au cristallin au stade post-embryonnaire; Figure 31A). Chez la deuxième descendance, l’expression embryonnaire du transgène diffère également de celle de Hes4a, puisqu’on l’observe dans toute la rétine neurale aux stades vésicule et cupule optique. Cependant, à des stades plus tardifs, elle s’éteint dans la rétine centrale et se confine progressivement, comme celle d’Hes4, à la pointe de la ZMC post-embryonnaire (Figure 31B). Il est possible que cette différence de patron d’expression au cours de l’embryogenèse soit liée à la grande stabilité de l’eGFP. Alternativement, la séquence promotrice clonée (seulement 500 pb) n’est peut-être pas suffisante pour reproduire le patron d’expression de Hes4 au cours de la rétinogenèse embryonnaire.

Figure 30 : Analyse des animaux transgéniques rapporteurs de l’activité du promoteur

Hes4a (génération F0).

A. Schéma simplifié de la construction rapportrice de l’activité du promoteur Hes4a. La

séquence codante de l’eGFP ou de la TurboGFP est clonée en aval du promoteur Hes4a (promHes4). B. Analyse comparative par hybridation in situ de l’expression de Hes4, eGFP et TurboGFP sur des embryons transgéniques eGFP (a, b),

promHes4a-TurboGFP (c) ou sauvages (d) de la génération F0 (vues in toto et sur coupes transversales de

rétines). Beaucoup d’embryons transgéniques affichent des expressions ubiquitaires du transgène y compris dans la rétine (a). Cependant quelques-uns présentent un marquage spécifique dans la ZMC (b, c), plus au moins similaire à celui de Hes4 (d). Échelle: 1 mm.

eGFP ou TurboGFP! promHes4a!

A!

pH es 4a-e G FP ! pH es 4a-T u rboG FP ! Génération F0 au st41! Hes4 !

B!

a! b! c! d!

Figure 31 : Analyse des animaux transgéniques rapporteurs de l’activité du promoteur

Hes4a (génération F1).

Analyse comparative par hybridation in situ au cours de la rétinogenèse de l’expression de

Hes4 et eGFP sur des embryons transgéniques promHes4a-eGFP ou sauvages de la

génération F1. A. Coupes transversales de rétines d’une descendance transgénique qui présente un patron d’expression aberrant de l’eGFP. Au stade 29/30, le transgène s’exprime dans la rétine centrale, dans l’EPR et dans le cristallin. Au stade 41, son expression s’éteint dans la rétine centrale et persiste dans l’EPR et dans le cristallin. B. Comparaison dans une autre descendance F1 du profil d’expression de Hes4 et de celui du transgène

promHes4a-eGFP. Leurs domaines d’expression ne coïncident pas aux stade précoces de la rétinogenèse

(stades 25 à 37), mais sont similaires dans la rétine mature (stade 41 ; expression confinée à la pointe de la ZMC). Cr: Cristallin ; EPR : épithélium pigmenté rétinien ; RC : rétine centrale. Échelle: 50 µm. eGFP ! St29/30! St41! A! CR! RC! EPR! CR! RC! EPR! eGFP ! Hes4a ! St28! St25! St35! St37! St41! B!

Ces résultats préliminaires en F1 doivent être confirmés. Un doute subsiste quant à la capacité du promoteur à reproduire le patron embryonnaire d’Hes4 mais il semble qu’il suffise à reproduire son expression dans la rétine mature. Nos animaux transgéniques devraient donc constituer un outil précieux dans un contexte plus général d’étude des cellules souches rétiniennes, en permettant leur visualisation spécifique à des stades post-embryonnaires. Si le transgène s’avère également refléter correctement le profil d’expression de Hes4 au cours de la rétinogenèse embryonnaire, nous clonerons cette fois une GFP photoconvertible (GFP Kaede) (Scott et al., 2007) en aval du promoteur en vue de réaliser des expériences de lignage.

Dans le document Rôle des répresseurs transcriptionnels Hes1/4 dans la maintenance des cellules souches rétiniennes chez Xenopus laevis (Page 153-157)